本发明专利技术是一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，属于蛋白质组学技术领域。采用的技术方案是选择胰蛋白酶水解得到的特定肽段，其特异性是指该肽段仅由胰蛋白酶水解产生，而其他蛋白质和蛋白质药物不能由胰蛋白酶水解产生。肽段；基于液相色谱-串联质谱技术，以平行反应监测模式对特定肽段进行扫描分析，建立了稳定可靠的特定肽段LC/MS/MS定量方法。本发明专利技术具有高通量、高灵敏度、重现性好等；所用试剂和药物更便宜、更易获得，制备方法简单，有利于方法的推广。样品处理过程和定量方法简单易行，适用于其他蛋白质。药物和多肽药物的定性和定量研究具有指导意义。

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【技术实现步骤总结】

该专利技术属于蛋白质组学

，涉及一种治疗性单克隆抗体药物贝伐单抗(i)的药代动力学质谱分析方法。

技术介绍

单克隆抗体药物是一类基于γ型免疫球蛋白（G）结构的具有特殊治疗作用的蛋白质药物。对待。与传统的小分子药物或中药制剂相比，单克隆抗体药物具有明显的药理活性和优良的药代动力学特性；单克隆抗体在体内代谢程度低，可在体液中长期保持高浓度。消除半衰期平均数周至数月。因此，及时建立标准化、可靠的分析方法，开展单克隆抗体药物的药代动力学研究，对支持单克隆抗体药物的研发具有重要意义。现在，蛋白质类药物的药代动力学研究多采用酶联免疫吸附法（-，）和放射免疫法（，RIA）。其中，因其灵敏度高，适合批量测定，已成为蛋白质和多肽类药物生物样品分析最常用的方法。但在单克隆抗体药代动力学实验中，该方法的定量范围较窄（通常为一到两个数量级），无法同时分析不同形式的单克隆抗体（即单克隆抗体）药物，存在开发周期长。（六个月到几年）、成本高（每个靶药几十万到几百万）、无法区分内源蛋白的干扰等，极大地影响了量化的可靠性和实用性。对于RIA方法，一些放射性标记分子的靶抗体会表现出与原型药物不同的吸收、分布和代谢特征；另外，放射性标记的单克隆抗体通常只能稳定存在2～3周，不能适应中长期。单克隆抗体的药代动力学研究。因此，建立标准化、可靠的分析方法对于单克隆抗体药物的开发具有重要意义。不能适应中长期。单克隆抗体的药代动力学研究。因此，建立标准化、可靠的分析方法对于单克隆抗体药物的开发具有重要意义。不能适应中长期。单克隆抗体的药代动力学研究。因此，建立标准化、可靠的分析方法对于单克隆抗体药物的开发具有重要意义。

技术实现思路

该专利技术要解决的技术问题是克服现有蛋白质药物药代动力学分析方法影响定量的可靠性和实用性的不足，建立单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法。本专利技术采用的技术方案是选择胰蛋白酶水解得到的特定肽段，其中特异性是指该肽段仅由胰蛋白酶水解产生，而其他蛋白质和蛋白质药物不能由胰蛋白酶水解产生。肽。基于液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）技术，在平行反应监测（PRM）模式下对特定多肽进行扫描分析，建立了稳定可靠的特定肽段LC/MS/MS定量方法。上述方法可用于达到正常肽片段的定量水平。正常肽是待测肽。该专利技术的具体技术方案如下。一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述的单克隆抗体药物为贝伐单抗()；按照以下7个步骤进行血浆样品中单克隆抗体浓度的测定；( 1)血浆样品的还原：将2 μL大鼠血浆样品加入聚乙烯管中，加入96 μL含有变性剂的pH缓冲液，涡旋混匀；加入2 μL还原剂，涡旋混匀；60℃孵育°C 1小时得到反应溶液；(2) 半胱氨酸封闭：在反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡旋混匀；25°(：避光孵育；(3)血浆样品胰蛋白酶消化：在半胱氨酸封闭的反应液中加入消化缓冲液，涡旋混匀，加入3 μL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，室温孵育37 ℃ 12~16h 得到血浆样品酶解液，加入5 μL 甲酸终止反应； (4) 内标引入：在酶解液中加入10 个稳定同位素标记的内标肽段，得到血浆样品的反应液；（<@血浆反应液的固相萃取：在固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液至液体自然流出；向固相萃取柱中加入1 mL洗脱液，直至液体自然流出；反应液，至液体自然流出；在固相萃取柱中加入1mL洗脱液，至液体自流，洗涤3次；在固相萃取柱中加入1mL洗脱液，至液体自然流出，取血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；(6)

标准曲线y = 0.+0.，建立过程包括标准系列溶液的配置和大鼠血标准曲线样品的制备；所述单克隆抗体标准系列溶液的配置为mAb标准溶液储备液（25 μg/μυ稀释至5、10、40、100、50< @0、100<@用去离子水，分别为0、/yL；大鼠血浆标准曲线样品的制备有以下7个步骤，（1)大鼠血浆标准曲线样品的还原：加单克隆抗体标准系列溶液2 μL；加入大鼠空白血浆2 μL，涡旋混匀；加入含有变性剂的pH缓冲液94 μL，涡旋混匀；加入还原剂2 μL，充分混匀；@5)单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品反应液固相萃取：固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流出；在固相萃取柱中加入1mL洗脱液，直至液体自然流出；取步骤(4)得到的单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品反应液加入固相萃取柱固相萃取柱中，加入1mL洗脱液至固相萃取柱，直至液体自然流出，洗涤3次；在固相萃取柱中加入1mL洗脱液至液体自然流出，得到单一抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中； ( 6) 单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品的浓缩和复溶：真空离心，将单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品的洗脱液蒸干，加入0.1%甲酸，涡旋混匀，得到单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品复杂的解决方案；(7)单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析：取2 μL单克隆抗体大鼠血浆标准曲线样品复合溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，取单克隆抗体浓度以初始单克隆抗体标准系列溶液为横坐标，酶解后特异性肽的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，

专利技术的治疗性单克隆抗体药物的质谱分析方法，含有变性剂的pH缓冲液为含有8M尿素的50mM缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液）；还原剂为1M二硫苏糖醇溶液；半胱氨酸封闭剂为固体碘乙酰胺试剂；消化缓冲液为50mM缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液）；胰酶溶液为1mg/mL胰酶水溶液；冲洗液为水/三氟碳（按体积比计）

【技术保护点】

一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述单克隆抗体药物为贝伐单抗；血浆样品中单克隆抗体浓度的测定按以下7个步骤进行；(1)血浆样品还原：将2 μL大鼠血浆样品加入聚乙烯管中，加入96 μL含有变性剂的pH缓冲液，涡旋混匀；加入2 μL还原剂，涡旋混匀；孵育60℃反应1小时，得到反应液；（2)半胱氨酸封闭剂：反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡旋混匀；25℃孵育C 在黑暗中；（3)血浆样品胰蛋白酶消化：在半胱氨酸封闭的反应液中加入 700 μL 消化缓冲液，涡旋混匀，然后加入3 μL胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，37℃孵育12-16 h，得到血浆样品酶解液，加入5 μL甲酸终止反应；(4)内标引入：在酶解液中加入10 μL稳定同位素标记的内标肽，涡旋混匀，得到血浆样品的反应液；(<@5)内容血浆反应液 固相萃取：在固相萃取柱中加入 1 mL 乙腈溶液至液体自然流出；在固相萃取柱中加入洗脱液 1 mL 至液体自然流出；取反应液血浆样品溶液直至液体自然流出 向固相萃取柱中加入 1 mL 洗脱液，至液体自然流出，洗涤3次；向固相萃取柱中加入1 mL洗脱液，直至液体自然流出，得到血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；(6)血浆样品浓缩复溶：真空离心干燥血浆样品洗脱液，加入100 μL0.1%甲酸，涡旋混匀，得到复溶血浆样品溶液；(< @7)血浆样品质谱分析：取血浆样品复溶溶液2 μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，代入所选特异性肽的峰面积与峰的比值内标面积标准曲线y=0.+0.，

【技术特点总结】

【专利技术性质】

技术研发人员：胡良海、丛玉婷、杨波、张张、顾景凯、

申请人（专利权）持有人：吉林大学，

类型：发明

国家、省、市：吉林；22

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